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液相色谱操作中这10则常见的经典
作者:固拓多肽合成公司    发布于:2024年07月16日
摘要:1.如何维护色谱柱?答:①建议在检测前过滤样品和流动相。②建议每天完成样品后及时清洗。③常规检测:测试后,将色谱柱直接反向连接,用90%的有机相冲洗45分钟,最后保存在纯甲醇或纯乙腈中。④使用缓冲盐条件:a.等度条件

1. 如何维护色谱柱?

答:①建议在检测前过滤样品和流动相。

②建议每天完成样品后及时清洗。

③常规检测:测试后,将色谱柱直接反向连接,用90%的有机相冲洗45分钟,最后保存在纯甲醇或纯乙腈中。

④使用缓冲盐条件:

a.等度条件:在使用缓冲盐之前和之后,以1ml/min流速冲洗45min。

b.梯度条件:在使用缓冲盐之前,与初始流动相相同的过渡流动相以1ml/min流速冲洗45min。

注意

①过渡流相是指有机相和水相的比例与分析流相同,但不含缓冲盐。

②缓冲盐冲洗后,用90%有机相反冲洗60分钟,最后保存在纯有机溶剂中。

③使用缓冲液不能在色谱柱中过夜。

2.氨基柱在进入酸性样品时,对柱非常有害,如使用一段时间后,柱效降低,峰形变化,如何恢复?

答:5-10倍柱体积含0.5-1.0%乙腈-水(50:50)溶液冲洗柱(冲洗后当然要用无碱流动相冲洗多余氨),然后分析这类酸性分析物时,建议在流动相中加入少许氨,如0.1%。

3.液相色谱中峰出现拖尾或双峰的原因是什么?

答:①筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,更换筛板或柱子。

②有干扰峰,解决办法是使用较长的柱子,更换流动相或更换选择性好的柱子。

③柱子可能超载,减少进样量。

4.HPLC灵敏度不足的主要原因及解决办法是什么?

答:①样品量不足,解决办法是增加样品量。

②样品不从柱子中流出,可根据样品的化学性质改变流动相或柱子。

③样品与检测器不匹配,根据样品的化学性质调整波长或更换检测器。

④检测器衰减过多,可以调整衰减。

⑤探测器的时间常数太大,解决办法是降低时间参数。

⑥检测器池窗污染,解决办法是清洗池窗。

⑦检测池内有气泡,解决办法是排气。

⑧如果记录仪测压范围不当,可以调整电压范围。

⑨流动相流量不合适,调整流速即可。

⑩检测器和记录仪超过校正曲线,解决办法是检查记录仪和检测器,重作校正曲线。

5.做HPLC分析时,柱压不稳定,原因是什么?如何解决?

答:①泵内有空气,解决办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理。

②比例阀失效,更换比例阀即可。

③泵密封垫损坏,更换密封垫即可。

④溶剂中的气泡,解决办法是对溶剂进行脱气,必要时改变脱气方法。

⑤系统检漏,找出泄漏点,密封即可。

⑥梯度洗脱,此时压力波动正常。

液相色谱操作中这10则常见的经典

6.HPLC柱验收测试时柱压过高,请问为什么?

:柱压过高是HPLC柱用户最常遇到的问题。原因有很多,往往不是柱子本身的问题。您可以按照以下步骤检查问题的原因:

①拆下保护柱,看柱压是否还高,否则就是保护柱的问题,如果柱压还高,再检查一下。

②从仪器上取下色谱柱,看压力是否下降,否则管道堵塞,需要清洗,如果压力下降,再次检查。

③将柱子的进出口反过来连接到仪器上,用10倍柱体积的流动相冲洗柱子(此时不要连接检测器,防止固体颗粒进入流动池)。此时,如果柱压仍不下降,请再次检查。只用于使用过的柱子。

④更换柱入口筛板。如果柱压降低,则表明您的溶剂或样品中含有颗粒杂质。正是这些杂质堵塞了筛板,导致压力上升。如果柱压仍然很高,请联系制造商。一般来说,在进样器和保护柱之间连接在线过滤器可以避免柱压过高的问题。

7.为什么会出现峰宽?

答:①样品体积过大:用流量配样,总样品体积小于第一峰的15%。

②在进样阀中引起峰扩展:进样前后排出气泡以减少扩散。

③数据系统采样速度过慢:设定速率应大于每峰10点。

④流动相粘度过高:提高柱温,采用低粘度流动相。

⑤检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器。

⑥保留时间过长:等度洗脱时增加强溶剂含量,也可采用梯度洗脱。

⑦柱外体积过大:将连接管的直径和长度降到最低。

⑧样品过载:进入小浓度小体积样品。

8.流动相气泡的原因是什么?

答:①由于有氧气或空气的溶解,流动相溶液中经常形成气泡。

②液路阻力较大,吸液时出现真空气泡。

③当系统开始工作时,无法清除流路中的空气。

④注入样品时混入空气。

9.实验室脱气的常用方法有哪些?

答:①加热回流脱气,脱气效果最好,但不能保持。

②氦气脱气,这种方法脱气效果好,能去除90%以上的空气,但氦气价格太贵,所以用的不多。

③真空脱气,效果仅次于氦脱气,但在脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失。

④超声波脱气,只能去除约30%的空气,但最常用于实验室。目前仍尽量使用在线脱气,方便,效果好。

10.氨基柱在进入酸性样品时,对柱非常有害,如使用一段时间后,柱效降低,峰形变化,如何恢复?

答:5-10倍柱体积含0.5-1.0%乙腈-水(50:50)溶液冲洗柱(冲洗后当然要用无碱流动相冲洗多余氨),然后分析这类酸性分析物时,建议在流动相中加入少许氨,如0.1%。

写到最后:


杭州固拓生物科技有限公司定制多肽合成业务:药物肽、临床肽、订书肽、淀粉肽、醛肽、环肽、二硫键搭桥多肽、穿膜肽、各种抗菌肽、美容肽、磷酸化肽、PEG肽、偶联BSA和KLH抗原肽、各类酸修饰多肽、各种胺类化合物修饰多肽(苯胺、异戊胺、二乙胺)、各类荣光标记(FITC、FAM系列、DOTA、TAMRA系列、CY系列)同位素肽等。固拓生物所有产品仅限科研使用,不得用于人体,如有违反,后果自负。


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