多肽合成

无论是商品化蛋白或是公司内部自身开发设计的蛋白 ，在提纯得到蛋白到应用以前通常必须保存第几周至好多个月不一 。 

在此期间维持蛋白理化性质的稳定性尤为重要 ，文中简略介紹了造成蛋白质集聚，沉积 ，转性等情况的要素 ，并详细介绍了一些 保存对策来提高蛋白质的可靠性 。 

如今就带大伙儿打开浓浓的干货知识之行 。

蛋白质 理化性质改变的要素

蛋白质可靠性发生问题的第一个特点通常是发生沉积 ，沉淀中通常带有非纯天然的蛋白质集聚物，且这类集聚一般是不可逆的，通常不能够修复自然的蛋白质的功能 ，除非是将集聚物融解于转性液，如尿素溶液或盐酸胍中，再根据复性除去转性液使蛋白质分子再次折叠 ，修复纯天然构像 。

（1）强烈 刺激性 下的蛋白质 沉积 及应对措施

多种多样强烈的伤害可以造成蛋白沉淀 ，包含pH 值转变 ，环境温度转变，融冻 ，在拌和（蛋白质暴露于气体 -水页面 ），过虑 （蛋白质暴露于液体 -固态页面 ）等，以上要素均可以造成蛋白空间布局的转变，进而产生沉积 。

当溶液中非纯天然蛋白质集聚物充足小时 ，如二聚体，四聚体等，蛋白质可以维持可溶解情况 。 

掌握这种集聚物的成分水准十分关键 ，由于 与纯天然 蛋白 对比 ，其构造和活力很有可能早已 发生了转变 ，即使这种集聚物保持 在2%-3%那样很低的水准 ，也可以拼装形核 ，进而推动蛋白质迅速的集聚和沉积。 

这就可以表述为何某类 蛋白在比较稳定的保存 一段时间后，忽然 产生很多沉积，可溶集聚 物在做到开启能量源转化成的阀值水准以前沉积不容易 产生 ，将带有可溶集聚物的蛋白质暴露于强烈的条件中，如拌和或过虑 ，可以更快的推动能量源的生成和沉积 。

（2）氨基酸主链发生变化造成蛋白质沉积及应对措施

除开 强烈刺激性 ，氨基酸主链发生变化也是蛋白沉淀的主要要素 ，如有氧化和水解反应到时候导致蛋白作用 改变 。

酶促反应结构域 处的甲硫氨酸残基的氧化会造成蛋白质失活，在甲硫氨酸和胱胺酸 残基及其带有芳香族主链的氨基酸 （谷氨酸 ，组氨酸和酪氨酸 ）最易于产生化学作用 ，分子结构氧的存有 ，赋形剂及其 器皿中还原性污染物质都能够引物设计化学作用 ，比如带有氧化还原反应活力的金属离子，瓶盖中带有残余的原子团残渣等均可造成化学作用 ，一般添加一些增稠剂 ，如绵白糖 ，对纯天然情况夯实 ，可以减缓暴露残废的氧化率。

水解作用既可以出现在氨基酸的主链 （像天冬酰胺和谷氨酰胺残基 产生的脱氟苯 功效）还可以产生在肽碳链 上，造成肽官能团的激光切割 ，天冬酰胺残基的脱氟苯功效高宽比在于相邻的残基 ，若下一个氨基酸是甘氨酸 ，其溶解的速率更快 。 

多肽链部分的软性可以危害脱氟苯 功效 ，大部分主要的外界因素 如pH 值，缓冲溶液类型可以加快这些反映 ，在碱性 pH 和浓度较高的的缓冲溶液中，反应速率尤其快。

蛋白质普遍的多种保存方法

（1）在液体状态下不冻结保存

蛋白质一般在2-8℃开展 短期内保存 ，这对保持蛋白的可靠性尤其合理 ，殊不知蛋白质即使不产生集聚沉积 ，也会产生迟缓的化学降解过程 ，蛋白质在溶液情况下的集聚水平最少 ，大部分蛋白质平稳的pH范畴较小，在这里范畴以外，蛋白质去折叠的工作能力加强。 

非特异性增稠剂 ，如绵白糖 ，在其浓度做到 0.5 M时，对保持 蛋白质的可靠性具备不错的实际效果 。 很多添加物，如硫酸铵，甘氨酸 ，聚乙二醇 ，绵白糖 等，可以根据优先选择 排阻 （PreferentialExclusion）的方式保持 蛋白质 的热学 可靠性 ，在其中柠檬酸钠盐缓冲溶液实际效果最好 。

此外 一种保持蛋白质可靠性不错的办法 是减少蛋白质的浓度 ，较低浓度的可以减少蛋白质的集聚率，这类速率对蛋白质的浓度十分比较敏感 ， 殊不知 ，蛋白质的浓度也不能过低，如小于0.1 mg /ml ，过较低浓度的的蛋白会导致非特异性的吸咐到器皿的内壁 ，进而导致损害 。

除此之外 ，蛋白质缓冲溶液的含盐量针对保持蛋白质 溶液的可靠性十分关键 ，如PBS缓冲溶液中，NaCl的浓度通常保持在150 mM ，这是由于溶液中正离子的电荷屏蔽掉减少了蛋白质分子间的电荷 -电荷 排斥功效 ，这种离子浓度的选择必须实际的实验提升 

（2）在冻结环境温度下保存

冷藏保存是蛋白质存储的基本方式 。 

在低溫情况下，蛋白质溶解的速度减少 ，在超低温不造成蛋白质产生转性时，试品可以平稳保存好多个 月，在-80 ℃甚至于 更低的环境温度 下，蛋白 的保存時间更久。

殊不知，冷藏也会造成很多蛋白的转性，这种要素包含超低温 ，物质的量浓度的浓度 ，冰-液体页面的产生 ，pH 值的强烈 波动 等。 

冻存蛋白最易犯的不正确是应用磷酸盐缓冲液 ，超低温下的碱性盐结晶体 ，而酸碱性盐依然可溶解 ，那样倍他米松 的pH值降低许多 ，如pH4，这会导致 很多蛋白产生转性 ，在冷藏期内 pH 不太发生变化的缓冲溶液有柠檬酸钠盐，Tris，组氨酸等。

在蛋白质溶液中添加保护剂可以合理减少蛋白转性 和沉积 ，这种方式 包含 ：添加凡士林 ，盐析盐和二糖，通常浓度高过 0.3 M，可具有不错的功效，添加表活剂 ，其能与蛋白质分子竞争冰-液体页面 来抑止 蛋白质变性，通常浓度 低至0.1 %，就能 得到有效的实际效果  ，添加 BSA 或高聚物 也可以抑止冷藏造成的蛋白质去折叠 ，一般添加占比为百分之几十 。 

根据 提升蛋白质的起止浓度 ，可以提高在融冻过程中蛋白质制取物对损害的耐受力 ， 当蛋白质的起止浓度提高时，转性蛋白质分子的百分数也会降低 。针对 -80 ℃和-20 ℃保存 ，优选 -80 ℃。 

一方面超低温可以比较大水平减少蛋白溶解速度 ；另一方面因为 -20 ℃电冰箱常常电源开关的特性 ，环境温度一般 达不上 -20℃，尤其是靠门的地区 ，特别是无霜冰箱中还会继续发生不断融冻的状况 。 

并且，-20 ℃贴近 一些 盐的共融点，在这个环境温度左右易导致结晶的不断融冻 ，造成蛋白质变性。 

最终必须指出的是，蛋白要避免重复融冻 ，散装冻存 ，每回融化 一支 ，随后应用 。

（3）冻干 保存

冻干是将溶剂或悬浮物质在较低温度下冷藏 ，随后将其由固态立即提升为气体的一种干燥方式 ，

该方式可以非常好地维持成分骨架的可靠性 ，而且在复融后都不 改变 。

冻干 一般 包含三个过程 ：预冻结，提升干燥 (或称第一阶段干燥 )，分析干燥 (或称第二阶段干燥 )，虽然冻干可以比较好 的保持蛋白的可靠性 ，可是 在冻干过程中加上必需的增稠剂以防止蛋白质的转性至关重要 ，这在其中并以还原型的海藻糖和绵白糖对蛋白质的维护最有效。 

冻干过程要避免应用还原型糖，如葡萄糖水，麦牙糖，乳清蛋白等，其会造成美拉德（Maillard）反映溶解蛋白质 ，在冷藏期内 ，维护水平在于起止的总糖 浓度 ；在干燥期内 ，维护功效在于糖与蛋白质的质量比。 

冷藏维护是因为从蛋白质表面的优先选择排阻 ，那样便提升了去折叠的活化能 ，在干燥期内 ，伴随着与蛋白质分子表面 产生水合作用的水被除去 ，蛋白质分子去折叠 ，糖可以 利用在冻干蛋白质的缺水部位融合氢氧根离子来防止这类毁坏 。

因为冻干加工工艺繁杂 ，设备价格昂贵，耗能比较大 ，这也是一般实验室承受不住的，通常做为蛋白保存的最终选择 。 

针对冻干初学者而言 ，设定下列状态变量会降低探索時间 ：制取蛋白的原始浓度相对性高些，可以提升对冷藏的耐受力 ，并降低要干燥的容积 ；应用充足的海藻糖或绵白糖来抑止在冷藏和干燥中的蛋白去折叠。 

假如蛋白质制剂可以承受冷藏 ，糖与蛋白质的质量比例在1-2中间 ，通常可以合理的防止在干燥过程中蛋白质的去折叠 。 在冷藏 期内 ，假如必须 维护 ，糖的起止浓度通常必须做到200 -300mM才可以达到最好维护 ，最终，必须明确的是蛋白质保存样本中，尽量不能带有蛋白酶，蛋白酶的催化具备精确性 ，催化高效率远远地高过有机物催化剂 。 

写到最后：

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