多肽合成

一、为什么多肽样品要先进行预处理才能上制备柱？还有什么预处理方法？

回答：与用来分析的色谱柱相比，制备用的色谱柱由于处理了大量的样品而更容易受到污染，对需要过柱的样品进行一些前处理可以有效地延长制备柱的使用寿命。

前处理方法主要有：萃取，过滤，离心，预柱等。

色谱柱

二、为什么在流动相中要加入三氟乙酸作离子对试剂？还可以使用什么流动相系统或离子对试剂来分离纯化多肽？

回答：固拓生物目前使用的流动相系统是水加乙腈，它使用三氟乙酸作为离子对试剂。针对不同肽段选择合适的梯度洗脱分离肽段。

同时，TFA可调节洗脱液PH值，作为离子对试剂与多肽相互作用，可增强分离效果，显著改善样品峰形。

流动相或离子对试剂也可用于多肽分离纯化：醋酸体系、磷酸体系、盐酸体系、七氟丁酸体系等。调整PH值同样可以获得良好的分离效果。

三、如何选择提纯时所用的色谱柱填料？

回答：不同序列在多肽的理化性质和疏水性方面存在很大差异。大多数情况下，C18柱的分子量小于4000，亲水多肽的分离效果最好。

以分子量大于5000，基端疏水性较好的多肽分离C4柱。

C8色谱柱介于C18和C4之间，其应用效果偏向于C18；对于某些特别选择性的多肽，还可用于苯基和聚合物色谱柱。

四、纯化过程中聚合物填料的选择原则有哪些？

回答：需要用温度条件进行或高于正常pH纯化时；可以用pH范围很宽的聚合物色谱柱。该方法具有在基端pH条件下不降解、用强酸和强碱作为流动相分离纯化等优点。

五、影响多肽纯度检验的因素是什么？

回答：肽类化合物纯度测定结果受多种因素的影响，包括：流动相系统，色谱柱的类型，柱温，波长和色谱仪的性能指标，这些不同会导致测定结果的误差。

六、反相层析分离提纯后，如何从流动相产品中除去TFA、乙腈等杂质？

回答：冷冻干燥的方法应能去除大部分TFA和乙腈，只要超出许可范围，这个方法就是简单有效的。有些要求TFA含量较高的药物肽冻干的方法通常不能完全达到要求，需要专门的盐化或脱盐。

七、多肽通常是什么类型的盐？盐的脱除是怎样进行的呢？

回答：大多数多肽是在TFA体系中分离纯化的，因此，多肽的主要形式为TFA盐，其次，药物肽一般为醋酸盐和盐酸盐，少数药物肽会有一些特殊的盐状。以离子交换法、HPLC法为主，透析袋、超滤膜均可用于脱盐。

八、TFA在缓冲液中的作用是否只是调节PH？基线漂移越大，TFA浓度越高，这是说当缓冲液PH允许时，TFA浓度越低越好吗？

回答：1.TFA作用类似于离子对，一般浓度为0.05-0.1%，浓度过高，会使溶液偏酸，长期使用可影响柱子寿命。

2.TFA对硅胶表面硅醇基有抑制作用，可改善碱性样品的峰型。有时候，0.1%的TFA是不理想的。可考虑增加浓度至0.2%。但注意用完后要及时冲洗色谱柱。

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