1、多肽合成

依照多肽合成常规操作合成多肽，HPLC检测纯度为95%。多肽C端增加的半胱氨酸残基用于以其巯基衔接于偶联剂上。

2、合成多肽与载体的偶联

载体蛋白选择 BSA/KLH（这里以BSA为例），用 SPDP衔接法将合成的多肽与 BSA 停止偶联：4.6mg SPDP 溶解于 740ul DMSO，终浓度为 20mM。0.1008g BSA 溶解于 2ml PBS-EDTA 溶液中，室温静置1h。运用脱盐柱洗脱多余的 SPDP。4mg 多肽参加偶联好的 BSA-SPDP 体系中室温过夜。

3、多抗的制备

选体重 1. 5～2 kg 的安康雄性新西兰大白兔， 按常规操作卡介苗活化其免疫系统。 将偶联的 BSA多肽过滤除菌，100mg（2ml）加等体积的不完整佐剂，充沛混悬。在新西兰大白兔背部多点皮下注射，4 周后增强免疫，其后每隔 2 周停止 1 次增强免疫，注射途径与初次免疫相同，共两次后，检测效价。耳源静脉采血、别离血清。

4、多抗的纯化

Protein G 柱别离纯化 IgG 抗体：PBS pH7.4 均衡 Protein G 亲和柱，以 0.1M Gly-HCl pH3.0洗脱， PBS pH7.4透析，分装，-20℃保管。

抗原亲和纯化：1mM 预冷的 HCl 充沛收缩 Sepharose 4FF后，15个体积的 1mM HCl清洗去残留的蔗糖，每次清洗 2min。偶联缓冲液 0.1M NaHCO3 pH8.3 0.5M NaCl 均衡2次。多肽溶于偶联缓冲液，调理pH值到pH8.3后，参加凝胶，室温混旋 3h。参加1M预冷的乙醇胺混旋2h阻断未偶联上的活化位点。 50mM Tris-HCl pH8.0，1MNaCl 溶液与 50mM Gly-HCl pH3.5，1M NaCl 交替清洗8次。PBS缓冲液均衡10 倍体积。装柱，均衡，上样后以 0.1M Gly-HCl pH2.2 洗脱，PBS 透析，分装，-20℃冻存。

5、抗体效价的检测

抗体效价的检测有ELISA办法或免疫双扩散法，这里以免疫双扩散法为例。

在制备的琼脂板上按 7 孔一组的梅花形打孔（中间1孔，四周6孔）孔径约 5mm，孔距 2mm~5mm， 汲取多肽抗原悬液滴入中间孔，等倍稀释的血清分别参加外周的对称孔中。37℃温箱中作用，于 24h 后察看结果。 以呈现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼扩效价。

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